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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷过酸呈现组学、LC-MS/MS磷过酸位点定量分析技术服务。
日语子标题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
繁体中文题目：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
朋友计量单位：山东大学
论述装修材料：拟南芥侧根
拜谱带来了方法：磷碱化绘制组学、LC-MS/MS磷碱化位点讲解
研究分析基本思路：
PART 01 钻研成果
01、滋生素利于VIK的磷过酸及转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷碱化淀粉酶质成分析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 生长发育素利于VIK的磷过酸名词解释转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷酸性反应研究。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过发酵粉双杂交育种概述（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶互补性激光散斑科学实验（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且离体磷硝化作用实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。及时定量分析PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素信息正极干预 LR 生长
能够数据分析3个VIK T-DNA放变化体（vik-2和vik-3），看到与野生穿山甲型相对比，变化体的LR体积密度计算公式、LR原基（LRP）和已发展的LR为显著缩减，十分是vik-2（图2）。反过来，过取决于VIK的转DNA植物体表面出LR体积密度计算公式加入。再者，在vik-2变化体图片背景下取决于VIK的转DNA植物体恢复原状了LR发展不足。胸部健康发育素治理实践取决于，vik-2变化体对胸部健康发育素诱发的LR发展反應减小，取决于VIK在胸部健康发育素政策调控LR发展中充分发挥重要性帮助。 
图2 VIK介导的种植素手机信号径路顺向房产调控LR的阴茎发育
03、VIK 与ERF13 来进行物理性等交互
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双团伙荧光互补原理 （BiFC）和免疫检测共结晶科学实验（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13间接用途
04、VIK以正负极馈的方案宏观调控ERF13磷硝化作用
通过磷硝化作用蛋清组学探讨，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点基因突变找到显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正反面馈方式英文磷碱化ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷硝化作用促进会ERF13生物降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过离体实验所性和人体内实验所性，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模拟仿真和磷酸解离突变率体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚组织细胞分享分享表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷碱化下载加速了ERF13挥发
06、VIK 介导的 ERF13 磷硝化作用调试 LR 的现身
分析进一部浅谈了VIK调空的ERF13溶解在侧根（LR）成长发育中的的功效。确认较为各种不同的转人类基因沉水树种系的LR表型，遇到过体现ERF13能够抑止了LR的遇到，在vik突变的体中这样的能够抑止的功效怎强，而在过体现YFP-VIK的游戏 背景下这样的能够抑止的功效削弱（图6）。于此，较为ERF13的各种不同的磷硝化作用模以和磷酸灭活进化体的过体现沉水树种系，遇到ERF132A-Myc（磷酸灭活）的沉水树种系LR遇到越来越少，而ERF132D-Myc（磷硝化作用模以）的沉水树种系LR遇到略多。以上导致体现了，VIK介导的ERF13磷硝化作用和溶解加快了LR的遇到。 
图6 VIK介导的ERF13磷过酸促进会LR的出现了
07、VIK在侧根成长中磷硝化作用并相对稳定LBD18血清
使用研究的两个VIK T-DNA复制到变化率体（vik-2和vik-3），知道与原生态型比较，变化率体的侧根（LR）规格单位、LR原基（LRP）和已发展的LR有明显以减少，特别是在是vik-2（图7）。颠倒，过表达爱出VIK的转遗传DNA根系表演出LR规格单位加强。虽然，在vik-2变化率体背景图片下表达爱出VIK的转遗传DNA根系恢复正常了LR发展障碍。种植素处置试验阐明，vik-2变化率体对种植素诱导型的LR发展症状弱化，阐明VIK在种植素调空LR发展中切实发挥根本用处。 
图7 VIK 在LR变成操作过程中直接的磷过酸和固定LBD18淀粉酶
PART 02 小文章个人总结
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷硝化作用营养素质组学研究分析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的生长发育素讯号调准侧根变成
PART 03 拜谱工作小结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的高血清质组学、绘制高血清质组学、细胞代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—很高广度DIA·磷碱化体现组，采用创新聚集技术水平+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现节肢动物子样本量10w+、草木子样本量5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
符合专著：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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